半滑舌鳎星形胶质细胞系的建立与鉴定【欧锦赛线上买球】

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更新时间:2021-07-08

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半滑舌鳎星形胶质细胞系的建立与鉴定【欧锦赛线上买球】

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鱼类细胞培养始自20世纪60年代。

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本文摘要:鱼类细胞培养始自20世纪60年代。

鱼类细胞培养始自20世纪60年代。自从1962年,Wolf和Quimby首次创建了鱼类细胞系,即虹鳟生殖腺细胞系RTG-2[1]以来,鱼类细胞培养研究发展十分迅速。

目前为止,全世界已报导创建的鱼类细胞系多达有280株,其中来自淡水鱼或溯河繁殖的海洋鱼类细胞系有175株,来源还包括71个科的89种鱼类;海水鱼类细胞系有100株,还包括23个科的35种海水鱼类获取的有所不同的组织或胚胎。我国鱼类细胞培养跟上于20世纪70年代末[2]。至今已建构约60株鱼类细胞系。细胞系相对于动物活体,在实验可重复性以及成本方面具备很大的优势。

鱼类细胞培养作为一种最重要的研究手段,被广泛应用在鱼类生理学、免疫学、内分泌学、病理学、遗传选育、病毒学、环境毒理学、肿瘤及基因工程、药物学等多个领域[3-8]。细胞系的创建方法也有多种,从启动原代培育到传代培养成系,要根据所萃取的组织的状况,及细胞生长特性科学合理的自由选择培育手段,鱼类原代培育还包括的组织块法、酶消化法、机械分离法、漂浮细胞培养法、网合剂集中法和微载体培育法等。目前较为常用的方法是酶消化法、的组织块法、网合剂集中法、机械分离法。

机械集中法限于于细胞间连接更为牢固的的组织,如幼鱼全鱼、胚胎,此法利用重复剪切、断裂等物理手段使的组织块充份集中,然后搜集游离细胞和小的组织块展开培育。比如将剪成至约1mm3大小的的组织块放进底部衬有铜网的注射器内,用力将的组织吸管通过网孔,然后就可以搜集培育集中的的组织。

的组织块法限于于取材于艰难,的组织量较少时,用无菌眼科剪成将的组织剪成至约1mm3大小的的组织块,使其张贴在瓶壁上展开培育,细胞不会自的组织块边缘向外迁入生长。网合剂集中法主要用作囊胚期细胞培养及上皮样细胞的传代,主要利用金属螯合剂EDTA等清理细胞间Ca2+、Mg2+后使细胞间连接牢固,铁壁细胞经吹打才可集中,但是缺点是该方法集中细胞效果较好,一般来说还必须与酶消化液牵头用于。酶消化法是目前尤为常用的方法,可用作绝大多数的组织器官的消化培育,根据其离解的组织的程度有所不同,可将其分为两种:一类是几乎消化法,是通过酶消化相结合机械吹打的手段,将的组织块最大限度的集中为单个细胞来培育;一类是不几乎消化法,即酶起到时间较短,将的组织块消化为小的组织块和游离细胞的混合产物来展开培育。

最常用的的组织消化酶还包括胰蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶。这几种酶可分开用于,也可牵头用于。

经常使用胰蛋白酶和胶原酶牵头消化,胰蛋白酶的常用浓度为0.25%-0.5%。胶原酶常用于含有较多结缔组织或胶原成分的质地的的组织的消化。胰蛋白酶消化法可以根据酶消化温度的有所不同分成冻消化法和热消化法。

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冻消化法是将的组织剪大约2mm3大小的的组织块,置放5~10倍体积的胰酶中低温4℃消化过夜;热消化法中酶的起到温度一般来说是15~20℃,起到时间30~60min。将的组织分离出来展开原代培育是细胞培养的第一步也是最重要的阶段。漂浮培育的对象主要是淋巴细胞及部分肿瘤细胞。

在鱼类细胞培养中,适合的培养基也是要求培育工作顺利与否的最重要因素,有所不同鱼类,以及完全相同鱼类有所不同的组织,合适其生长的培养基也不尽相同。鱼类细胞系常用典型培养基为MEM(Eagle’sMinimumEssentialMedium),L-15(LeibowitzMediumL-15)或M199(Medium199),添加剂为10-20%胎牛血清,HEPES或碳酸氢盐缓冲液。

血清能有助细胞贴壁,能增进细胞生长,是细胞培养中不可缺少的营养成分,细胞初始培育时常用血清浓度为10~20%,继代培育时培养基中血清含量可增加为5~10%。胎牛血清不仅能为细胞生长获取营养补足,增进细胞贴壁,还能维护细胞免遭重金属,蛋白酶等物质的受损。根据必须,有的时候可以加到鱼血清或的组织提取物与胎牛血清因应用于,必须留意的是同种鱼的血清对细胞有毒性。

此外,不应尽量搭配同一批号的胎牛血清,用于前应先置放56℃水浴锅中1h以杀菌支原体,避免支原体污染。鱼类细胞培养常用的盐溶液有磷酸缓冲溶液(PBS)、Hank,s液(HBSS)等。还不会向培养液中加到一种或几种增进细胞分裂细胞分裂的生长因子,少见有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF),其中bFGF具备反感增进体外培育细胞增殖的起到,起到浓度一般为2-10ng∕ml。

EGF能增进表皮细胞、成纤维细胞等多种细胞的分化细胞分裂,其起到浓度一般为1-25ng∕ml。为了避免细胞培养过程中由于培育者操作者失当引发的细菌交叉污染,还需向培养基中加到适度的抗生素。常用青霉素(100U∕ml)和链霉素(100ug∕ml)来避免细菌污染,两性霉素B(2ug∕ml)能用来避免真菌污染。原代细胞经过一段时间培育后汇集成单层,然后就要展开传代培养。

用来消化鱼类贴壁生长的细胞所用消化液为0.05%胰酶特0.02%EDTA,酶的起到温度一般为室温。传代细胞经过一段时间的生长,数量急遽下降,此事要作好细胞的留存工作,继续不必的培育细胞可以用所含冷藏保护剂(二甲基亚砜或者甘油)的培养基展开梯度降温冻存,最后留存于液氮中。原代培育物由多种不同类型细胞包含的,随着传代,生长过程中分化快或不分化的细胞类型渐渐被筛除,不适应环境培育及成分的细胞也被筛除,生长分化充沛的细胞类型渐渐占优,适应环境生长的细胞沦为培育的主体。

大部分细胞系在体外培育过程中不存在受限时间段,即约传代50次后,将暂停分化生长而渐渐凋亡丧生,这些类型细胞系称作受限细胞系,然而有些细胞系则能通过转化成取得永生性,从而在体外长年存活,这些细胞系称作连续性细胞系或永生性细胞系1.2鱼类细胞培养历史及进展从20世纪60年代鱼类细胞培养跟上至今,其研究范围从创建细胞系,分离出来病毒发展到展开环境毒理评估,基因功能分析,免疫系统调控研究,RNA阻碍,以及IPS技术等方面的研究,获得阶段性的进展。20世纪60年代到20世纪80年代,鱼类细胞系的创建工作开始跟上。在欧美发达国家,一些淡水及溯河洄游鱼类,如鲑鳟鱼类的细胞系被创建。

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1962年,美国科学家Wolf和Quimby创建了虹鳟生殖腺细胞系(RTG-2),公开发表在《Science》杂志上。1965年,Gravell和Malsberger创建了一个肌肉细胞系(FHM)[9],此后,剑尾鱼胚胎细胞系SWT、大西洋鲑体内的组织细胞系AS[10]等鱼类细胞系陆续被创建。

这世纪末创建了近40株鱼类细胞系[11]。当时细胞系主要应用于在水生生物病毒分离出来与检验。而后的十几年,随着用作细胞培养的鱼类种类及的组织来源的激增,鱼类细胞系的创建发展很快。

至1994年,鱼类细胞系数目约159株。我国鱼类细胞培养的研究也有所发展。张念慈和杨广智于1981年用草鱼颌末端的组织建构了两个细胞株[12]。

1986年,左文功等创建了草鱼肾脏的组织细胞系CIK[13]。我国台湾学者郭光雄和陈秀男于1988年创建了鳗鲡卵巢细胞系EO-2[14],同年,李焕林等创建了草鱼颌末端细胞系PSF。

1992年,美国学者Collodi等探寻研究了斑马鱼胚胎干细胞的分离出来与培育[15];1994年,日本学者Wakamatsu等在训鳉中创建了多能性胚胎细胞系[16]。这世纪末,世界下有34株海水鱼类细胞系被创建。

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鱼类细胞系数目的激增,以及横跨融合众多生命科学热门研究领域,使得细胞系作为优良的体外传达体系其应用于范围更进一步不断扩大。新世纪伊始,鱼类细胞培养获得突破性进展:鱼类细胞系数量轻微减少;细胞培养牵涉到鱼类的品种大量减少,由鱼类扩展到甲壳类和海产贝类,而且的组织来源发展到一些肿瘤细胞和癌细胞;鱼类细胞系的应用于范围更进一步伸延,已由全然的病毒分离出来、毒理学、免疫学、遗传学扩展到近些年研究的基因组学、表观遗传学、基因敲除、RNAi以及iPS等各个方面。.5.3环境对鱼类性别分化影响低等脊椎动物,两栖类、爬行类及鱼类的表型性别是由遗传因素、环境或者社会因素联合要求。

温度可以影响大多数鱼类的性别分化[61]。鱼类性别要求是在受精卵发育成成体过程中,由遗传物质要求分化成雌性还是雄性。然而温度对鱼类性别要求的影响主要展现出在鱼类发育的特定阶段,温度对仔鱼的性腺发育产生影响,从而转变鱼类性别分化的方向。

鱼类中最先报导的关于环境影响鱼类性别要求影响的例子是月银汉鱼(Menidiamenidia),实验找到在有所不同温度条件下取得的雌雄鱼比例不一样,低温处置的后代中雌鱼偏多。罗非鱼的性别要求主要是由遗传要求的,但其受到环境因子影响时,雌雄后代性别比例发生变化。

高温处置尼罗罗非鱼群体,群体中雄鱼比例明显增高,因为部分遗传雌性罗非鱼性翻转沦为雄性。高温对罗非鱼雄性化的影响主要原因有可能是高温阻碍了长时间雌鱼性别分化发育的过程,促成遗传雌鱼翻转为生理雄性;高温还有可能参予了雄性化激素的黏液强化。然而对罗非鱼展开低温诱导研究表明,在性腺分化的关键阶段,低温处置仔鱼,性别比例并没产生显著性差异。

对欧洲鲈鱼发育有所不同阶段展开有所不同温度诱导结果表明欧洲鲈鱼的性别比例与温度关系密切,高温时鱼群雄性化强化,而在低温时雌性化强化,温度性别的可塑性较为大。邓思公平通过对半湿舌鳎组织学仔细观察找到,圈养条件为控温24℃下,仔鱼在产卵后30天性腺开始分化,具备裂隙的性腺原基发育为卵巢,反之不具裂隙的最后发育为精巢,30天左右为半湿舌鳎性别分化的关键阶段,高温可使仔鱼雄性比例增高。1.6蛋白转导与蛋白转染对鱼类生理机能产生影响蛋白转入细胞的途径有多种,还包括蛋白转导和蛋白转染。蛋白转导(Proteintransduction)就是利用蛋白本身具备的转导结构域将外源蛋白转至细胞的过程。

Green和Frankel首次找到经过体外重组传达,并且提纯后的HIV-1的TAT蛋白与细胞展开联合产卵,TAT蛋白需要自律穿过细胞膜转入细胞,通过其自身在细胞中的准确定位充分发挥一定的生物活性[62,63]。接着,Fawell找到如果将TAT结构域与异源蛋白展开融合,异源蛋白可以必要被转至细胞内,这个实验指出TAT有可能具备运输蛋白的能力,即具备蛋白转导能力。1997年,Vives等更进一步找到经过剪切的TAT蛋白(47-57AA)也某种程度具备蛋白转导功能,由此解释该区域是蛋白转导结构域[64]。

1999年,Schwarze等还找到将TAT蛋白转导结构域与分子量为116kDa的β-半乳糖苷酶融合后的重组融合蛋白经过腹膜注射法静脉注射小鼠后,找到TAT-β半乳糖苷酶融合蛋白需要通过血脑屏障,在小鼠的肝、脾、肺、肾、心肌、脑等完全所有的组织中检测到具备活性的融合蛋白的不存在[65]。对于不具备蛋白转导结构域的蛋白,利用蛋白转染载体也能协助目的蛋白转染入细胞,有学者通过两种手段制取包覆有目的蛋白的阳离子脂质体展开小鼠脾细胞转染,通过免疫荧光,免疫系统印迹检测,SDS凝丙烯酰胺的方法检测转染效果,结果找到这两种方法制取的脂质体都能将目的蛋白转染入细胞,且转染效果无显著性差异[66]。

蛋白转染将目的蛋白转至细胞主要是通过脂质体法将目的蛋白包覆一起,构成小的颗粒,再行通过细胞内吐等生理活动将包覆有目的蛋白的颗粒并转入细胞中,但是外来的颗粒在细胞中会被溶酶体消化,所以用脂质体包覆转染蛋白不会有部分蛋白被消化,然而没被消化的脂质体包覆颗粒就不会转入细胞质中,获释重组蛋白,被获释的重组蛋白可能会有部分再度被溶酶体消化,只剩的蛋白有可能就不会参予转染细胞的生理活动。如Zhou等利用蛋白转染法将蛋白抗原顺利转往T淋巴细胞并对其展开诱导[67]。Ignatius等利用脂质体法包覆卵白蛋白转入CD8+T细胞,结果找到在T细胞中能检测到卵白蛋白,并且找到T细胞产生接收者起到,结果表明卵白蛋白通过脂质体包覆法顺利转入T细胞,并且充分发挥了一定生物起到。

利用原核传达系统建构元和传达载体也是将目的蛋白转至细胞的手段,例如在大肠杆菌中传达装载蛋白转导结构域的SOX2等mRNA因子蛋白,然后将传达的mRNA因子蛋白与干细胞一起产卵,结果在细胞中检测到转导的目的蛋白,同时干细胞也找到被重组蛋白诱导分化,指出重组蛋白能顺利转导入细胞,并充分发挥生物活性[68]。半湿舌鳎雌雄鱼生长差异大,雌鱼比雄鱼生长速度快2-3倍,还具备性逆转现象,经常出现伪雄鱼,即雄鱼生理性别为雄性,具备精巢,但是遗传性别为雌性,具备雌性特异W染色体。随着半湿舌鳎仅有基因组测序工作的已完成,更加多的性别特异基因被挖出,利用现代先进设备的生物技术,这些基因的功能也渐渐明晰,但是性别涉及蛋白功能的研究尚能归属于跟上阶段,如果能融合脂质体转染,建构蛋白转导载体等手段将性别涉及调控基因产物转至鱼体功能细胞,研究其生物学起到以及其调控机理,对于更佳地展开半湿舌鳎选育,阐释其性别要求于性别分化机理都具备重大意义。


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